Ponowna reakcja na kryzotynib za pomocą Lorlatinibu ALK Resistance Mutation L1198F ad 6

Zgodnie z tymi wynikami fosforylacja ALK C1156Y-L1198F została skutecznie zahamowana przez kryzotynib, ale nie przez lorlatinib (ryc. S3 w Dodatku Aneks). Odkrycia te potwierdzają kliniczną obserwację, że C1156Y-L1198F powoduje oporność na lorlatinib, ale powoduje uczulenie na kryzotynib. Aby określić, czy mutacja L1198F może ponownie uczulić inne mutanty oporne na krizotynib, wygenerowaliśmy dodatkowe linie komórkowe Ba / F3 wyrażające pojedyncze i podwójne mutanty ALK. W prawie wszystkich przypadkach dodanie L1198F zwiększało wrażliwość na kryzotynib, ale promowało oporność na inne inhibitory ALK (ryc. S4 i tabela S2 w dodatkowym dodatku). W szczególności, dla wysoce opornej mutacji ALK G1202R (IC50, 382 nM), podwójny mutant (G1202R-L1198F) był prawie tak samo wrażliwy jak ALK typu dzikiego na krizotynib (IC50, 31 nM w porównaniu do 20 nM).
Następnie określiliśmy powinowactwa wiązania (Ki) domen dzikiego typu i zmutowanych kinaz ALK dla różnych inhibitorów ALK. Zgodnie z wynikami linii komórkowej, mutanty L1198F i C1156Y-L1198F miały zmniejszone powinowactwo wiązania do lorlatinibu, jak również innych inhibitorów ALK następnej generacji, w porównaniu do ALK typu dzikiego, ale zwiększone powinowactwo do kryzotynibu (Figura 2B i Tabela S3 w Dodatek dodatkowy). Przeciwnie, pojedynczy mutant C1156Y wykazał powinowactwo równoważne z ALK typu dzikiego dla kryzotynibu i loratynibu. Jednakże aktywność enzymatyczna mutanta C1156Y (Kcat / KM, substrat) była 5,6 razy większa niż w przypadku ALK typu dzikiego (tabela S4 w dodatkowym dodatku). Aktywność podwójnego mutanta C1156Y-L1198F była nieznacznie wyższa niż aktywność dzikiego typu (1,7 razy większa), podczas gdy aktywność mutanta ALK L1198F była faktycznie 2,5 razy mniejsza. Te dane biochemiczne sugerują, że zmiany w wiązaniu leku, bardziej niż zmiany w aktywności kinazy, są prawdopodobnie głównym mechanizmem leżącym u podstaw oporności C1156Y-L1198F na lorlatinib i wrażliwość na kryzotynib.
Badania strukturalne lekoopornych mutantów ALK
Określiliśmy struktury ko-kryształów dzikiego typu i zmutowanych domen kinazy ALK związanych z kryzotynibem lub loratynibem. Cysteina w pozycji 1156 (C1156) znajduje się daleko (13 .) od miejsca wiązania inhibitora i nie przewiduje się, że będzie bezpośrednio wpływać na wiązanie leku (Fig. S5 w Dodatku Aneks). Podstawienie C1156Y wpływa na uporządkowanie i pozycję końca pętli bogatej w glicynę, zwiększając aktywność kinazy.
Figura 3. Figura 3. Strukturalne podstawy oporności na Lorlatinib i wrażliwość na kryzotynib Mediowany przez ALK C1156Y-L1198F. Niefosforylowane domeny kinazy ALK typu dzikiego i zmutowane (C1156Y, L1198F, C1156Y-L1198F) były wspólnie krystalizowane z kryzotynibem lub loratynibem. Pokazano współkryształowe struktury kryzotynibu związane z pojedynczym mutantem ALK C1156Y (Panel A), lorlatinibem związanym z pojedynczym mutantem ALK C1156Y (Panel B) i krizotynibem związanym z podwójnym mutantem ALK C1156Y-L1198F (Panel C). Panel D pokazuje modelowanie lorlatinibu związanego z podwójnym mutantem ALK C1156Y-L1198F, podkreślając steryczny konflikt między resztą fenyloalaniny i lorlatinibem. L1122 jest resztą leucyny w pętli g, która tworzy kieszeń wiążącą z L1198F tuż nad piperydyną i grupami nitrylowymi
[patrz też: uzdrowiskowe leczenie sanatoryjne dorosłych kolejka, niemiarowość oddechowa, humektant ]