Ponowna reakcja na kryzotynib za pomocą Lorlatinibu ALK Resistance Mutation L1198F czesc 4

Wszystkie biopsje i testy molekularne przeprowadzono zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez instytucjonalną komisję rewizyjną w Massachusetts General Hospital. Badania genetyczne
Badania przesiewowe pod kątem rearanżacji ALK i amplifikacji protoonkogenu MET (MET) przeprowadzono przy użyciu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH), jak opisano wcześniej.10,18 mutacje oporności na ALK zidentyfikowano za pomocą ukierunkowanej następnej generacji sekwencjonowanie (NGS) assay19 i Sanger sekwencjonowanie komplementarnego DNA. Sekwencjonowanie całego egzaminu przeprowadzono zgodnie z opisem w dodatkowym dodatku, dostępnym wraz z pełnym tekstem tego artykułu pod adresem.
Badania linii komórek Ba / F3
Komórki Ba / F3 poddano obróbce w celu ekspresji związanego z mikrotubulami białka podobnego do mikrotubuli 4 (EML4) -ALK niosącego różne mutacje oporności na ALK. Testy przeżycia komórek przeprowadzono jak opisano wcześniej.13
Badania biochemiczne i strukturalne
Szczegóły metod oznaczania stałych hamowania Ki, charakterystyki kinetyczne i struktury ko-kryształów podano w Dodatku uzupełniającym. Struktury ko-kryształów zostały zdeponowane w Banku Światowych Danych Białkowych (identyfikatory 5A9U, 5AA8, 5AA9, 5AAA, 5AAB i 5AAC).
Wyniki
Analiza genetyczna odpornych próbek nowotworowych
Aby zidentyfikować mechanizm oporności u tego pacjenta, uzyskaliśmy próbkę biopsji zmiany wątroby, która powiększała się, podczas gdy pacjent przyjmował lorlatinib, abyśmy mogli wykonać testy molekularne. FISH wykazał przegrupowanie ALK i brak dowodów na amplifikację ALK (Figura 1D). Ponieważ MET jest hamowany przez kryzotynib i został zidentyfikowany jako potencjalny mechanizm oporności na bardziej selektywne inhibitory ALK drugiej generacji, 20 przeprowadziliśmy FISH, aby określić, czy MET zostało zamplifikowane (tj. Było wiele kopii MET w DNA nowotworu) . Nie zaobserwowano amplifikacji MET (Figura 1D).
Przy użyciu ukierunkowanego testu opartego na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) opartego na NGS (określanego jako Snapshot NGS), zidentyfikowaliśmy dwie mutacje w domenie kinazy ALK: C1156Y, która została wcześniej wykryta w biopsji tego pacjenta po krizotynibu i L1198F. Żadne inne mutacje w 38 genach związanych z rakiem (np. EGFR i KRAS) nie zostały wykryte za pomocą Snapshot NGS. ALK C1156Y jest znaną mutacją oporności na krizotynib, 17 natomiast ALK L1198F została zgłoszona jako mutacja zysku-funkcji w anaplastycznym raku tarczycy21 oraz jako mutacja oporności na brigatynib w połączeniu z F1174V w przestawionej nukleofosminowo-ALK linii komórkowej. 22 mutacje C1156Y i L1198F były obecne przy podobnych częstotliwościach (odpowiednio 29% i 35%) w guzie kobiety, co sugeruje, że dwie mutacje były na tym samym allelu genu fuzyjnego ALK. Aby to potwierdzić, zamplifikowano EML4-ALK z komplementarnego DNA pochodzącego z zamrożonej próbki guza, subklonowano produkty PCR do wektora pCR4-TOPO i zsekwencjonowaliśmy poszczególne kolonie bakteryjne (ryc. S1 w dodatku uzupełniającym). Dwie mutacje były na tym samym allelu.
Następnie wykonaliśmy sekwencjonowanie całego egzaminu próbek tkanki nowotworowej uzyskanych od pacjenta przed leczeniem, po nawrocie choroby, gdy pacjent otrzymywał kryzotynib, i po nawrotu choroby, gdy pacjent przyjmował lorlatinib.
[podobne: szpital limanowa poradnie, fonoholizm, usg ortopedyczne kraków ]