Syndrom z wrodzoną neutropenią i mutacjami w G6PC3 ad 5

Analiza sekwencji in silico za pomocą programu Sorting Intolerant of Tolerant (SIFT) 25 obliczyła, że prawdopodobieństwo, że ta mutacja jest łagodna wynosi 0,01. Analiza za pomocą programu PolyPhen26 przewidywała, że zmiana R253H prawdopodobnie zakłóca działanie glukozo-6-fosfatazy. Białko typu dzikiego jest konserwowane u ssaków, płazów, ryb kostnych i owadów. Badania funkcjonalne
Aktywność enzymatyczna G6PC3 z mutacją R253H
G6PC3 typu dzikiego i G6PC3 z mutacją R253H wyrażono w S. cerevisiae. Mikrosomy izolowano z drożdży transfekowanych G6PC3 typu dzikiego lub G6PC3 z mutacją R253H i badano pod kątem aktywności fosfatazy. Hydrolizowany glukozo-6-fosforan G6PC3 typu dzikiego i uniwersalny substrat fosforan p-nitrofenylowy (pNPP), jak wykazano w badaniach radioaktywnych (Figura 2C) i spektrometrycznych (Fig. 3 w Dodatkowym dodatku). Przeciwnie, poziom aktywności enzymatycznej G6PC3 z mutacją R253H nie przekraczał poziomu aktywności fosfatazy u drożdży transfekowanych pustym wektorem.
Apoptoza
Figura 3. Figura 3. Zwiększona wrażliwość na apoptozę w komórkach mieloidalnych i komórkach linii fibroblastów. Panel A pokazuje wykres sortowania komórek aktywowanych fluorescencyjnie (FACS) wskazujący, że neutrofile z krwi obwodowej od Pacjenta 5 zwiększyły spontaniczną apoptozę w porównaniu ze zdrowym rodzeństwem i zdrową kontrolą, która była leczona rekombinowanym ludzkim czynnikiem stymulującym kolonie granulocytów (rhG- CSF) (skale logarytmiczne). Podobnie apoptoza wywołana przez czynnik martwicy nowotworów . (TNF-.) była bardziej wyraźna u pacjenta. Panel B pokazuje analizę wzmocnionej apoptozy u pacjentów fibroblastów po ekspozycji na ditiotreitol w porównaniu z fibroblastami zdrowych kontroli. Panel C pokazuje wykres FACS różnicowanych in vitro szpikowych komórek progenitorowych transdukowanych wektorem kontrolnym (górny rząd) lub retrowirusowym wektorem kodującym G6PC3 typu dzikiego (dolny rząd). Komórki traktowano tunikamycyną, a apoptozę oceniano przez barwienie aneksyną V i jodkiem propidyny. Transdukowane komórki G6PC3 od Pacjenta 2 wykazują zmniejszoną podatność na apoptozę 16 godzin po indukcji tunikamycyną w porównaniu z transdukowanymi komórkami kontrolnymi. Dane są reprezentatywne dla dwóch niezależnych doświadczeń. MMP oznacza retrowirusowy szkielet, MMP-G6PC3-mcd24 konstrukt retrowirusowy zawierający sekwencję cDNA G6PC3 typu dzikiego i mysią cd24 jako gen reporterowy, a MMP-mcd24 konstrukt retrowirusowy zawierający tylko gen reporterowy.
Podobnie jak neutrofile od pacjentów z mutacjami w ELA2 10 lub HAX1, 12 neutrofilów krwi obwodowej od naszych pacjentów miało zwiększoną szybkość spontanicznej apoptozy. Apoptoza neutrofili została znacząco przyspieszona po indukcji TNF-. (Figura 3A) lub tunikamycyna (dane nie przedstawione), co oceniono przez barwienie aneksyną V i test aktywacji kaspazy 3/7, odpowiednio (patrz Fig. 4 w Dodatku Dodatek). Ponieważ G6PC3 jest powszechnie eksprymowany i ponieważ fenotyp naszych pacjentów nie był ograniczony do układu krwiotwórczego, przetestowaliśmy komórki niehematopoetyczne pod kątem podatności na apoptozę. Fibroblasty skóry od pacjentów z niedoborem G6PC3 miały zwiększoną podatność na apoptozę po wywołanym przez ditiotreitol naprężeniu w retikulum endoplazmatycznym (Figura 3B).
Aby dostarczyć dalszych dowodów na to, że ta forma ciężkiej wrodzonej neutropenii jest spowodowana przez mutacje w G6PC3, wyizolowano hematopoetyczne komórki macierzyste CD34 + od dwóch pacjentów i transdukowano konstruktami retrowirusowymi zawierającymi sekwencję cDNA G6PC3 typu dzikiego i mysią cd24 jako gen reporterowy (MMP -G6PC3-mcd24) lub tylko gen reporterowy (MMP-mcd24)
[przypisy: implanty zębów, stomatolog Warszawa, gabinet stomatologiczny Warszawa ]