Syndrom z wrodzoną neutropenią i mutacjami w G6PC3 ad

Pomimo wglądu w rolę apoptozy w wrodzonej neutropenii, 12,16,17, mechanizmy neutropenii i ryzyko białaczki u pacjentów z ciężką wrodzoną neutropenią są nie do końca poznane. Zgłaszamy zespół złożony z ciężkiej wrodzonej neutropenii, innych wrodzonych nieprawidłowości i mutacji biallelicznych w G6PC3, genu kodującym glukozo-6-fosfatazę, katalityczną podjednostkę 3. Metody
Pacjenci i kontrole
Pobraliśmy próbki krwi i szpiku kostnego od pacjentów i zdrowych ochotników za ich pisemną świadomą zgodą. Badanie zostało zatwierdzone przez instytutowy zespół kontrolny Hannover Medical School.
Metody analityczne
Genotypowaliśmy markery mikrosatelitarne w skanie całego genomu dla rodziny z ciężką wrodzoną neutropenią, z rodowodem zidentyfikowanym jako SCN-I. Sprzęt i protokoły do genotypowania zostały opisane wcześniej.12 Przeprowadzono analizę powiązań genetycznych za pomocą kombinacji sylogizmów ilościowych i jakościowych. Decyzje ilościowe zostały podjęte przy użyciu punktów lodowych i optymalnych frakcji rekombinacyjnych obliczonych za pomocą oprogramowania Superlink.18,19 W celu obliczenia wyników dla jod, modelowaliśmy neutropenię jako całkowicie penetrantową autosomalną recesywną chorobę bez fenokopii i częstość alleli choroby wynoszący 0,001 . Mapa Marshfield20 została użyta do wyboru użytecznych markerów do precyzyjnego mapowania. Aby uzyskać szczegółowe informacje, patrz Dodatek dodatkowy, dostępny wraz z pełnym tekstem tego artykułu na stronie.
Exony i flankujące granice intron-egzon z potencjalnych genów zostały zamplifikowane przez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) i analizowane przy użyciu oprogramowania ABI PRISM 3130 DNA Sequencer i DNA Sequencing Analysis, wersja 3.4 (Applied Biosystems) i Sequencer, wersja 3.4. (Gene Codes Corporation). Patrz Dodatek Aneks dotyczący sekwencji starterów i szczegóły analizy polimorfizmów długości restrykcyjnej częstotliwości mutacji R253H u zdrowych osób z grupy kontrolnej.
Promieelocyty sortowano według sortowania komórek aktywowanych fluorescencyjnie, jak opisano wcześniej, 17 z niewielkimi modyfikacjami. Analizę ekspresji genów G6PC3 i HSPA5 / BiP / Grp78 przeprowadzono przy użyciu Roche LightCycler 2.0 (patrz Dodatek dodatkowy).
Całkowicie otwarte ramki odczytu dzikiego typu i zmutowanego G6PC3 amplifikowano za pomocą PCR i klonowano w pYES-cup1 (zmodyfikowane z pYES-NT [Invitrogen]), jak opisali Ashikov i wsp., 21 i wyrażono w Saccharomyces cerevisiae. Odwirowanie przy 100000 xg dało frakcję mikrosomalną, którą badano pod kątem hydrolizy glukozo-6-fosforanu do glukozy przez dodanie 14C-glukozo-6-fosforanu (MP Biomedicals). Uwolnioną 14C-glukozę oddzielono od glukozo-6-fosforanu przez wymianę anionową i zmierzono w eluacie za pomocą ciekłego scyntylacji.
Lizaty pełnokomórkowe z pierwotnych granulocytów rozdzielono przez elektroforezę z dodecylosiarczanem sodu-poliakryloamidem na żelu (SDS-PAGE), poddano blottingowi i wybarwiono przeciwciałami przeciwko fosfo-Mcl-1 (Ser159 / Thr163), całkowitą kinazę syntazy glikogenu 3. (GSK- 3.), fosfo-GSK-3. (Ser9) (wszystkie z Cell Signaling Technology / New England Biolabs), Bip / Grp78 (BD Biosciences) i dehydrogenaza gliceraldehydo-3-fosforanu (GAPDH) (Santa Cruz Biotechnology) (patrz Dodatek Dodatek).
Próbki szpiku kostnego od pacjentów i zdrowych osób z grupy kontrolnej poddano lizie hipotonicznej
[hasła pokrewne: badania lekarskie do pracy jak wygladaja, protezy zębowe bydgoszcz, neurolog w koninie ]